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Netzhautvernarbungen in einem experimentellen Kaninchenmodell der proliferativen Vitreoretinopathie zu verhindern.Dies wird hauptsächlich über die clathrinabhängige Internalisierung polymerer Mizellen, die nachgeschaltete Unterdrückung kanonischer EMT-Transkriptionsfaktoren, die Verringerung der Hyperproliferation und Migration von RPE-Zellen vermittelt.Der Nuclear Factor Erythroid 2-related Factor 2-Signalweg wurde in einem genomweiten Transkriptom-Profiling als Schlüsselsensor und -effektor identifiziert.Diese Studie hebt das Potenzial der Verwendung synthetischer biofunktioneller Polymere hervor, um das zelluläre Verhalten von RPE zu modulieren, und bietet eine potenzielle Therapie zur Prävention von Netzhautnarben.Eine fehlerhafte Wundheilung, die zu irreversibler Fibrose führt, liegt vielen pathologischen Erkrankungen zugrunde.Im Auge manifestiert sich dies als proliferative Vitreoretinopathie (PVR), eine Hauptursache für schlechtes Sehvermögen aufgrund einer fehlgeschlagenen Operation zur Netzhautablösung (RD)1,2.PVR tritt aufgrund von proliferativen und kontraktilen fibrozellulären Narbenmembranen auf, die sich entweder im Glaskörper oder in der Umgebung der Netzhaut bilden.Die Bildung dieser fibrozellulären Membrangewebe, die als epiretinale Membranen (ERMs) oder subretinale Membranen (SRMs) bezeichnet werden, wird hauptsächlich durch retinale Pigmentepithelzellen (RPE) angetrieben, die eine epithelial-mesenchymale Transition (EMT) durchlaufen haben3.Diese transformierten RPE-Zellen können einen wandernden Phänotyp annehmen und Myofibroblasten-ähnliche Zellen mit kontraktilen Eigenschaften bilden4,5, was zu rezidivierenden Traktions-RDs führt.Klinisch ist PVR eine schwierig zu behandelnde Komplikation, die eine komplexe chirurgische Entfernung erfordert, mit vorsichtiger Prognose für die Wiederherstellung des Sehvermögens6,7.PVR hat eine komplexe Pathogenese, an der mehrere Wege beteiligt sind, darunter Entzündungen, Fibrose und EMT4.Von zahlreichen Zytokinen wie Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α), transformierendem Wachstumsfaktor beta (TGF-β) und Interleukin-6 (IL-6) ist bekannt, dass sie proinflammatorische und profibrogene Reaktionen im Auge regulieren8.Darüber hinaus wurde traditionell beschrieben, dass Transkriptionsfaktoren aus der Snail-and-Twist-Familie eine Rolle bei der EMT im Auge spielen, jedoch nicht der Signalweg Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2)3,9.Obwohl viele Behandlungen untersucht wurden, die auf diese Signalwege abzielen, gibt es bis heute kein wirksames pharmakologisches Mittel zur Vorbeugung oder Umkehrung von PVR10,11.Darin besteht ein unerfüllter klinischer Bedarf, einen Ansatz zur Prävention und Behandlung von PVR und allgemeiner anderer Arten von anomaler Wundheilung zu entwickeln.Synthetische polymere Hydrogele sind eine Klasse von Biomaterialien, die aufgrund ihrer einstellbaren und vielseitigen physikalisch-chemischen Eigenschaften häufig in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen eingesetzt werden12,13,14.Sie können in verschiedenen Zuständen existieren, wenn sie aus amphiphilen Blöcken bestehen11.Bei niedrigen Konzentrationen in wässrigen Lösungen haben amphiphile Polymere die Fähigkeit, sich spontan zu polymeren Mizellen zusammenzulagern, sobald sie ihre kritische Mizellenkonzentration (CMC) überschritten haben15,16,17,18,19.Polymere Mizellen werden aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften häufig als Vehikel zur Arzneimittelabgabe für verschiedene Therapeutika verwendet20.Dazu gehören Biokompatibilität, Bioverfügbarkeit, Wirkstoffbeladungskapazitäten, große Solubilisierungskapazität und verlängerte Zirkulationszeit in vivo21,22,23,24.Über ihre Funktion als bloße physikalische Wirkstoffträger hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass künstlich hergestellte Polymermaterialien die Wechselwirkungen zwischen Material und Zelle beeinflussen, indem sie einfach ihre physiochemischen Eigenschaften abstimmen25.Dies schließt das Potenzial ein, zelluläres Verhalten wie Apoptose, Proliferation und Migration zu beeinflussen26,27,28.Allerdings ist wenig über die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bekannt, die dieses zelluläre Phänomen steuern, noch wurde es für therapeutische Anwendungen nutzbar gemacht.In dieser Studie untersuchten wir, ob ein bestimmtes thermoresponsives Multiblock-Polymer, bestehend aus Poly(ethylenglykol) (PEG), Poly(propylenglykol) (PPG) und Poly(ε-caprolacton) (PCL), genannt Poly(CEP) , ist in der Lage, eine fehlerhafte Wundheilung im Auge zu verhindern.Wir zeigen, dass das polymere Material selbst in der Lage ist, die Netzhautvernarbung sowohl in einem experimentellen PVR-Kaninchenmodell in vivo als auch in einem in vitro induzierten RPE-Kontraktionsmodell zu hemmen.Dies wird über die intrazelluläre Aufnahme von Poly(CEP) vermittelt, was zur Aktivierung des NRF2-Signalwegs in RPE-Zellen führt.Poly(CEP) wurde wie beschrieben synthetisiert und charakterisiert (ergänzende Abb. 1 und ergänzende Tabelle 1)19,29.Ein chirurgisch induziertes experimentelles Kaninchenmodell von PVR wurde eingerichtet, um die In-vivo-Wirksamkeit von Poly(CEP) bei der Verhinderung von Netzhautnarben zu testen (Supplementary Movie 1).In diesem experimentellen PVR-Kaninchenmodell wurde nach Kernvitrektomie und Induktion von RD eine intravitreale Koinjektion von immortalisierten RPE-Zellen (ARPE-19-Zelllinie) und Kaninchenblut (ergänzende Abb. 2a) durchgeführt.Es wurde berichtet, dass die Injektion von RPE-Zellen und Blut die intraokulare Narbenbildung durch die Bildung von kontraktilen fibrozellulären Membranen potenziert30.Der PVR-Schweregrad wurde bei allen Versuchskaninchen abgestuft (Ergänzungstabelle 2).Wenn nur Luft injiziert wurde, um als vorübergehende Glaskörpertamponade zu dienen (n = 5), wurden am Tag 2 eine Kontraktion und Einfaltung der Netzhaut durch Infrarotreflexions- (IR) und Spektraldomänen-Optische-Kohärenz-Tomographie (SD-OCT)-Bildgebung beobachtet (Ergänzung Abb. 2b).Diese schritt in allen 5 Fällen bis zum 10. Tag zu RD fort (PVR-Grad 5), wobei die Netzhautablösung in den Farbfundus- und IR-Bildern (weiße Pfeile, Abb. 1a) zu sehen war und im SD-OCT bestätigt wurde.In Augen, die mit 20 % Schwefelhexafluorid (SF6, n = 5) gefüllt waren, einem Gas, das routinemäßig in der Klinik als kurzzeitige Glaskörpertamponade verwendet wird31, wurde das Vorhandensein von ERMs mit fokaler Netzhauttraktion (PVR-Grad von 2) in 4 von ihnen beobachtet 5 Fälle, mit RD und kontrahierter Netzhaut (PVR-Einstufung von 5), die im fünften Fall nach 2 Monaten beobachtet wurden.Dies steht im Gegensatz zu mit 10 Gew.-% Poly(CEP) gefüllten Augen (n = 8), wobei die Erhaltung der Netzhautstruktur bei SD-OCT und das Fehlen von ERM (PVR-Einstufung von 1) in 7 von 8 Fällen beobachtet wurde. und PVR Grad 2 wurde im achten Fall beobachtet.In allen 8 Fällen heilten die Retinotomien und die Netzhaut blieb bis zu 2 Monate nach der Operation befestigt (ergänzende Abb. 2c – e).Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auf die Überlegenheit von Poly(CEP) bei der Verhinderung von PVR hin.a Repräsentative ophthalmologische Bilder hinterer Augensegmente von Kaninchen aus nicht operierten (n = 5), Poly(CEP)- (n = 8) und SF6-gefüllten (n = 5) Augen am 14. Tag nach der Operation und luftgefüllt Auge (n = 5) (experimentelles PVR-Modell) am Tag 10 nach der Operation.Farbfunduspanel: Sowohl nicht operierte als auch Poly(CEP)-gefüllte Augen zeigten einen normalen klaren Fundus mit anhängender Retina.Das mit SF6 injizierte Auge zeigte einen verschwommenen Augenhintergrund mit verschwommenem Blick auf die Gefäße.Luftgefülltes Auge zeigte eine vollständig abgelöste Netzhaut (weißer Pfeil).IR-Feld: Sowohl das nicht operierte als auch das mit Poly(CEP) gefüllte Auge zeigten ein normales hinteres Segment.Das SF6-injizierte Auge zeigte fibrotische Narbenmembranen, angezeigt durch die Streifen dunkler Schatten (weiße Pfeilspitzen).Das mit Luft gefüllte Auge zeigte einen dunklen Schatten (weißer Pfeil), der durch die abgelöste Netzhaut verursacht wurde.Maßstabsleiste, 2 mm.SD-OCT-Panel (Übersicht): Alle Gruppen außer luftgefüllt zeigten anhaftende Netzhaut.Maßstabsleiste, 200 µm.SD-OCT-Feld (vergrößert vom gepunkteten Kästchen): Sowohl nicht operierte als auch Poly(CEP)-gefüllte Augen zeigten normale stratifizierte Netzhautschichten.Das mit SF6 injizierte Auge zeigte das Vorhandensein einer Narbenmembran (weiße Pfeilspitze).Luftgefülltes Auge zeigte eine vollständig abgelöste Netzhaut.Maßstabsleiste, 50 µm.b Histopathologische Charakterisierung von enukleierten Kaninchenretinas aus allen vier Gruppen zu den in (a) genannten Zeitpunkten.Die Netzhaut des nicht operierten (n = 3) und des mit Poly(CEP) gefüllten Auges (n = 4) sah morphologisch ähnlich aus, mit dem Vorhandensein von unterschiedlichen und organisierten Netzhautschichten und einem kontinuierlichen einschichtigen RPE (schwarze Pfeilspitzen).SF6-injiziertes Auge (n = 2) zeigte ERM, das eine Netzhauttraktion verursachte.Das luftgefüllte Auge (n = 2) zeigte eine gefaltete Netzhaut mit desorganisierten Netzhautschichten und einer Narbenmembran (schwarz gepunktete Umrisse).Das native RPE war mehrschichtig.c Die Histologie der Netzhaut 2 Monate nach der Operation zeigte, dass das mit Poly(CEP) gefüllte Auge (n = 4) die im nicht operierten Auge sichtbare Netzhautschichtorganisation beibehielt.Die Netzhaut des mit SF6 gefüllten Auges (n = 3) hatte das Vorhandensein von ERM und SRM (schwarz gepunktete Umrisse).Sowohl für b als auch c wurde aufgrund der Probenverarbeitung eine artefaktische Gewebetrennung beobachtet (schwarze Sterne).Maßstabsleiste, 100 µm.d Netzhautquerschnitte aller Gruppen 2 Wochen nach der Operation wurden mit Fibrosemarkern, α-SMA und COL1A1 immungefärbt.Nicht operierte und mit Poly(CEP) gefüllte Augen (n = 4) zeigten eine minimale Färbung aller Marker in allen Netzhautschichten.SF6-gefüllte Augen (n = 2) zeigten eine intensive Färbung von sowohl α-SMA als auch COL1A1 in beiden präretinalen fibrotischen Membranen (weißer Pfeil).Luftgefüllte Augen (n = 2) hatten eine signifikante intraretinale Hochregulierung von COL1A1 mit Co-Lokalisation von α-SMA in den epiretinalen und äußeren Netzhautschichten (weiße Pfeilspitzen).e Netzhautschnitte von Poly(CEP)- (n = 4) und SF6-gefüllten (n = 3) Augen 2 Monate nach der Operation wurden mit α-SMA und COL1A1 immungefärbt.Sowohl Poly(CEP)-gefüllte als auch nicht operierte Augen (n = 3) wiesen eine minimale α-SMA- und COL1A1-Färbung auf, im Gegensatz zu SF6-gefüllten Augen, die eine positive Färbung sowohl in den epiretinalen (oberes Netzhautfeld) als auch in den subretinalen Zonen (unteres RPE) aufwiesen -CC-Panel).Kerne wurden mit Hoechst-Färbung blau gefärbt.Maßstabsleiste für d, e, 50 µm.CC = Choriokapillaris.ERM = epiretinale Membran.GCL = Ganglienzellschicht.INL = innere Kernschicht.IPL = innere plexiforme Schicht.IS/OS = innere/äußere Segmente des Photorezeptors.ONL = äußere Kernschicht.OPL = äußere plexiforme Schicht.PVR = proliferative Vitreoretinopathie.RPE = retinales Pigmentepithel.SRM = subretinale Membran.Um festzustellen, ob Poly(CEP) in der Lage ist, sowohl epiretinale als auch subretinale Narbenbildung in der Netzhaut von Kaninchen zu verhindern, wurde 2 Wochen und 2 Monate nach der Operation eine Ex-vivo-Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Färbung durchgeführt (Abb. 1b, c).Eine normale Kaninchen-Netzhautstruktur mit einem intakten darunter liegenden RPE wurde in allen Augen beobachtet, die nur mit Poly(CEP) gefüllt waren (ohne Induktion von PVR, n = 5 nach 2 Monaten, ergänzende Abb. 3), ähnlich wie bei nicht operierten Kontrollaugen (n = 5).In luftgefüllten Augen (n = 5), die in allen 5 Fällen RD und kontrahierte Netzhaut entwickelten, wird nur ein repräsentativer Bereich mit einer teilweise befestigten Netzhaut gezeigt (Fall #5).Hier war die Netzhaut selbstgefaltet und es fehlten deutliche Netzhautschichten.Subretinal wurde auch mehrschichtiges Narbengewebe beobachtet, was auf eine mögliche Hyperproliferation und Fibrose hindeutet.In experimentellen PVR-Kaninchenaugen gefüllt mit Poly(CEP) (n = 8) wurde bis zu 2 Monate postoperativ eine normale Netzhautstruktur beobachtet, vergleichbar mit den nicht operierten Kontrollaugen.Die meisten Fälle entwickelten keine ERMs (6 von 8) und keiner entwickelte SRMs.Dies steht im Gegensatz zu SF6-gefüllten Augen (n = 5), bei denen ERMs und SRMs in 4 von 5 Fällen beobachtet wurden, was zu lokalisierter Netzhauttraktion und Netzhautverzerrung führte, die beide bekanntermaßen einer PVR vorausgehen.Das Vorhandensein von ERMs und SRMs wurde weiter durch Immunfluoreszenzmikroskopie (IF) charakterisiert, um Alpha-Glattmuskelaktin (α-SMA) und Kollagen Typ I Alpha-1-Kette (COL1A1) (Abb. 1d, e), bekannte Schlüsselmarker für Fibrose, sichtbar zu machen stark exprimiert in Membranen, die von PVR-Patienten seziert wurden32.Bei den nicht operierten Augen (n = 5) war die Netzhautstruktur gut erhalten, ohne fibrotische Marker.In den luftgefüllten Augen (n = 2) waren 2 Wochen nach der Operation α-SMA- und COL1A1-Expression sowohl in den epiretinalen als auch in den subretinalen Zonen vorhanden, was auf eine schwere Fibrose und das Vorhandensein von ERMs und SRMs hinweist.Darüber hinaus wurde intraretinal eine COL1A1-Hochregulierung beobachtet, was die fibrotische Reaktion im experimentellen PVR-Modell bestätigt33.Im Gegensatz dazu fehlten beide Marker in den epi-, intra- und subretinalen Zonen von mit 10 Gew.-% Poly(CEP) gefüllten Augen sowohl nach 2 Wochen (4 von 4 Fällen) als auch nach 2 Monaten (4 von 4 Fällen).In Übereinstimmung mit den H&E-Ergebnissen gab es nach 2 Monaten eine intensive α-SMA- und COL1A1-Expression sowohl in den epiretinalen als auch in den subretinalen Membranen von SF6-gefüllten Augen (3 von 3 Fällen).Dies deutet darauf hin, dass 10 Gew.-% Poly(CEP) die Bildung von aberranter epi- und subretinaler Fibrose in einem experimentellen Kaninchenmodell von PVR verhindern konnten.Poly (CEP) erfährt reversible Phasenänderungen, von Unimeren zu polymeren Mizellen, wenn die Konzentration zunimmt, und von einem Lösungs- zu einem Gelzustand, wenn die Temperatur zunimmt (ergänzende Abb. 4a).Wenn Poly(CEP) im Gelzustand in den Glaskörperraum injiziert wird, wird es hauptsächlich durch Oberflächenerosion und Ablösung seiner Komponentenmizellen über einen Zeitraum von 3 Monaten biologisch abgebaut, bevor es durch partielle Hydrolyse von Esterbindungen mit PCL-Segmenten in seine Oligomere vollständig biologisch abgebaut wird14 ,29,34.Wir stellten die Hypothese auf, dass Mizellen, die während des biologischen Abbaus in vivo aus Poly(CEP)-Hydrogel freigesetzt werden, die biologische Funktion sowohl der injizierten ARPE-19-Zellen als auch des nativen Kaninchen-RPE beeinflussen und dadurch eine abweichende fibrotische Reaktion und retinale Narbenbildung verhindern können.Vor dem Testen dieser Hypothese wurde die CMC von Poly(CEP) bei Körpertemperatur (37 °C) im Basalzellkulturmedium auf 0,03 Gew.-% bestimmt (ergänzende Abb. 4b, c).Die Mizellengröße bei verschiedenen Konzentrationen wurde unter Verwendung dynamischer Lichtstreuung quantifiziert.Die durchschnittliche Mizellengröße variierte nicht signifikant zwischen den niedrigsten (0,05 Gew.-%) und höchsten (1 Gew.-%) gemessenen Konzentrationen (bei 0,05 Gew.-%: 153,20 ± 3,96 nm; bei 1 Gew.-%: 154,43 ± 14,11 nm) (ergänzende Abb. 4d).Es wurde auch gezeigt, dass Poly(CEP)-Mizellen unter Verwendung von Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) bei Temperaturänderungen dynamische Form- und morphologische Änderungen von kugelförmig zu zylindrisch erfahren35.Um den zugrunde liegenden Mechanismus zu verstehen, durch den Poly(CEP)-Micellen retinale Narbenbildung verhindern konnten, untersuchten wir seine Wechselwirkung mit humanen embryonalen Stammzellen-abgeleiteten RPE (ES-RPE)-Zellen, die nativen humanen RPE-Zellen sehr ähneln36.Um eine lebende intrazelluläre In-vitro-Verfolgung zu ermöglichen, wurden ES-RPE-Zellen kultiviert und Poly(CEP) ausgesetzt, das mit einem Fluorescein-Derivat (F-Poly(CEP))37 konjugiert war.ES-RPE-Zellen wurden Poly(CEP)-Micellen bei Konzentrationen unter CMC (0,001 und 0,01 Gew.-%) und über CMC (0,1, 0,5 und 1 Gew.-%) für 4 h ausgesetzt, und Fluoreszenz von internalisiertem Poly(CEP) wurde nachgewiesen durch Durchflusszytometrie.Es gab einen konzentrationsabhängigen Anstieg der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) mit einem Peak bei 1 Gew.-% (Abb. 2a), was darauf hinweist, dass die intrazelluläre Aufnahme von Poly(CEP) bei höherer Konzentration von Poly(CEP)-Micellen zunimmt.a Darstellung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) zeigte einen signifikanten Anstieg der zellulären Aufnahme von Fluorescein-konjugiertem Poly(CEP) (F-Poly(CEP)) bei Konzentrationen oberhalb der kritischen Mizellenkonzentration (CMC) (0,1, 0,5 und 1 Gew.-% ) im Vergleich zu Medien nur 4 h nach der Exposition.Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von vier Wiederholungen dar.b Wirkung verschiedener Endozytose-Inhibitoren auf die zelluläre Aufnahme (%) von 1 Gew.-% F-Poly(CEP).Die größte Abnahme des internalisierten F-Poly(CEP) wurde nach Exposition gegenüber Chlorpromazin, einem Clathrin-vermittelten Endozytose-Inhibitor, beobachtet.Eine minimale Internalisierung wurde beobachtet, wenn die Zellen auf Eis (4°C) gehalten wurden.Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von drei Wiederholungen für 4 °C und nur Medien und sieben Wiederholungen für die verbleibenden Gruppen dar.c Die intrazelluläre Aufnahme von 1 Gew.-% F-Poly(CEP) und seine Co-Lokalisierung mit Lysosom (markiert mit LysoTracker) wurde durch Immunfluoreszenz (IF) in Gegenwart oder Abwesenheit von Chloroquin (CQ), einem lysosomotropen Mittel, das Endosom verhindert, bestimmt Lysosomenfusion.Die Zugabe von CQ erhöhte die punktförmige Färbung von LysoTracker (grüne Pfeile).1 Gew.-% F-poly(CEP) mit LysoTracker zeigte das Vorhandensein von internalisierten Mizellen, die mit Lysosomen kolokalisiert sind (weiße Pfeile).Die Hinzufügung von CQ störte jedoch diese Kolokalisierung.Kerne wurden mit Hoechst-Färbung blau gefärbt.Der Einschub zeigt ein vergrößertes Bild aus dem gepunkteten Kästchen.Maßstabsleiste, Hauptfeld: 20 µm, Einschub: 10 µm.Ein repräsentatives Bild von drei unabhängigen durchgeführten Experimenten wird gezeigt.d Etablierung von TNF-α und TGF-β1 (TNT) in vitro RPE-Zellkontraktionsmodell von PVR.Zeitraffer-Phasenkontrast-Bildrahmen über einen Zeitraum von 72 h, die vier fortschreitende Stadien der RPE-Transformation nach der Behandlung mit TNT hervorheben.Der schwarze Pfeil zeigt auf die Narbenmembran.Maßstabsleiste, 50 µm.e Poly(CEP) wurde direkt oder indirekt RPE-Zellen ausgesetzt, wie im Schema gezeigt.Die indirekte Exposition von 10 Gew.-% Poly(CEP) verhinderte die Progression von RPE-Zellen über Stadium 1 hinaus. Die direkte Exposition von 1 Gew.-% Poly(CEP) verhinderte die Progression von RPE-Zellen über Stadium 1 hinaus in einer konzentrationsabhängigen Weise.Schwarzer Pfeil zeigt auf Membran.Maßstabsleiste, 100 µm.Es wird ein repräsentatives Bild von mindestens drei durchgeführten unabhängigen Experimenten gezeigt.f Die Anzahl der Membranen pro Well für alle Gruppen in (e) wurde manuell quantifiziert.Es gab eine signifikante, aber teilweise Hemmung der Membranbildung in 0,5 Gew.-% Poly(CEP) + TNT und eine vollständige Verhinderung sowohl in 1 Gew.-% Poly(CEP) + TNT als auch in 10 Gew.-% Poly(CEP) + TNT.Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von sieben Wiederholungen dar.Die Gating-Strategie für a, b ist in der ergänzenden Fig. 11a bzw. b gezeigt.Statistische Analysen für a, b und f wurden unter Verwendung von Einweg-ANOVA durchgeführt, gefolgt von Tukeys ehrlichem Signifikanzunterschied (HSD)-Post-hoc-Test.Als nächstes untersuchten wir den Weg, auf dem F-poly(CEP) in RPE-Zellen internalisiert wurde.Eine minimale Aufnahme von 1 Gew.-% F-Poly(CEP) in ES-RPE-Zellen (10,03 ± 6,70 %, P < 0,0001) wurde bei 4 °C im Vergleich zur Aufnahme bei 37 °C (92,24 ± 1,63 %) beobachtet (Abb. 2b).Dies bestätigte, dass F-Poly(CEP) eher durch einen aktiven, energieabhängigen Aufnahmemechanismus als durch einfache Adhäsion von Mizellen an der Zelloberfläche in RPE-Zellen internalisiert wurde.Um festzustellen, dass F-Poly(CEP) durch Endozytose aufgenommen wurde, und um den beteiligten Endozytoseweg zu identifizieren, wurden Inhibitoren der Clathrin-vermittelten Endozytose (Chlorpromazin), der Caveolae-vermittelten Endozytose (Genistein), der Mikropinozytose (Amilorid) und der Lipid-Raft-abhängigen Internalisierung eingesetzt (Methyl-β-Cyclodextrin)38,39 verwendet.Chlorpromazin hemmte die zelluläre Aufnahme am stärksten mit der geringsten verbleibenden Internalisierung (26,22 ± 5,20 %, P < 0,0001), gefolgt von Genistein (69,26 ± 4,55 %, P < 0,0001), was darauf hindeutet, dass Clathrin-vermittelte Endozytose der vorherrschende Weg für Poly(CEP) war ) Internalisierung.Als nächstes wurde der Transport nach der Internalisierung analysiert, indem RPE-Zellen 1 Gew.-% F-Poly(CEP) in Gegenwart von entweder LysoTracker (einem Marker für Lysosomen) oder Chloroquin (einem lysosomotropen Mittel)40 ausgesetzt wurden, das die Lysosomenfunktion durch Erhöhung der intra- lysosomalen pH-Wert und verursacht eine Lysosomenakkumulation (Abb. 2c).1 Gew.-% F-Poly(CEP) co-lokalisiert mit LysoTracker nach 24 h, was auf seine Akkumulation in Lysosomen hinweist.Dies wurde durch die Zugabe von Chloroquin verhindert, was mit dem endo-lysosomalen Transport von internalisierten Poly(CEP)-Micellen in RPE-Zellen übereinstimmt.Um zu verstehen, wie die internalisierten Poly(CEP)-Micellen die Narbenbildung in vivo verhindern konnten, übernahmen wir ein TNF-α- und TGF-β1 (TNT)-induziertes RPE-Kontraktionsmodell von PVR41,42.Mit TNT behandelte RPE-Zellen wurden in vier verschiedenen Stadien einer EMT unterzogen, um über einen Zeitraum von 72 Stunden kontraktile fibrozelluläre Membranen zu bilden (Abb. 2d und ergänzender Film 2).Zuerst erhielten RPE-Zellen ein mesenchymal-ähnliches Aussehen (Stadium 1), gefolgt von einer Koaleszenz der Zellen (Stadium 2), um ERM-ähnliche Membranen zu bilden (Stadium 3), die sich dann zu einer kontraktilen Membran (Stadium 4) fortentwickelten, bevor sie schließlich angehoben wurden von der Gewebekulturplatte.Um das In-vivo-Szenario zu rekapitulieren, bei dem 10 Gew.-% Poly(CEP)-Hydrogel in den Glaskörperraum injiziert wurde, wurden 10 Gew.-% Poly(CEP) in die obere Kammer eines Gewebekultursystems mit zwei Kammern gegeben, getrennt durch einen porösen Polyesterfilter ( Porengröße von 400 nm) (ergänzende Abb. 5a).Die Porengröße von 400 nm sorgte dafür, dass nur einzelne polymere Micellen (Größenbereich: 139–154 nm), nicht aber große Micellaggregate, von der oberen in die untere Kammer diffundieren.Dies wurde weiter durch ein Farbstoffsolubilisierungsassay-Experiment gestützt, bei dem eine signifikante Mizellenablösung durch Oberflächenerosion nach 48 h mit einem kontinuierlichen Anstieg bis 96 h bestätigt wurde (ergänzende Abb. 5b – d).In diesem indirekten Expositionsassay konnte mizellares Poly(CEP) die Bildung von kontraktilen Membranen verhindern und ES-RPE-Zellen blieben im Stadium 1 (Abb. 2e).Um weiter zu bestätigen, dass dieses Phänomen auf die intrazelluläre Aufnahme von Poly(CEP) zurückzuführen ist, wurden ES-RPE-Zellen direkt drei Konzentrationen von Poly(CEP) (0,1, 0,5 und 1 Gew.-%) ausgesetzt, Konzentrationen, bei denen Mizellen bekannt sind bilden und von Zellen internalisiert werden (Abb. 2a).Wir beobachteten eine konzentrationsabhängige Unterdrückung der Membranbildung.Eine teilweise Hemmung der Membranbildung trat bei 0,5 Gew.-% auf (76,14 ± 27,41 Membranen, P = 0,0022) und wurde bei 1 Gew.-% Poly(CEP) + TNT vollständig gehemmt (Abb. 2f und ergänzender Film 3).Dies stimmte mit früheren Befunden überein, die zeigten, dass eine maximale Internalisierung von Mizellen bei 1 Gew.-% beobachtet wurde, und bestätigten, dass die Antinarbenwirkung durch die mizellare Form von Poly(CEP) verliehen wurde.Die Hyperproliferation trägt zur Bildung von retinalem Narbengewebe bei43.Daher untersuchten wir die Wirkung von Poly(CEP)-Micellen auf die Zellproliferation, indem wir die Expression des Proliferationsmarkers Ki6744 in RPE-Zellen bei drei verschiedenen Konzentrationen von Poly(CEP) (0,1, 0,5 und 1 Gew.-%) mit beiden überwachten TNT-induziertes In-vitro-Modell von PVR (Abb. 3a) und Exposition gegenüber Poly(CEP) allein (Abb. 3b).Die Anzahl Ki67-positiver Kerne in TNT-behandelten ES-RPE-Zellen war in Gegenwart von 1 Gew.-% Poly(CEP) reduziert, und dies korrelierte mit dem Fehlen einer kontraktilen Membranbildung.In ähnlicher Weise wurde in Gegenwart von Poly(CEP) allein eine signifikante Abnahme der mittleren Fraktion von Ki67-positiven Kernen in RPE-Zellen beobachtet, die 0,5 Gew.-% (21,14 ± 4,41 %, P = 0,002) und 1 Gew.-% (19,39 ± 2,75 %, P = 0,0005) Poly(CEP) im Vergleich zur Kontrolle nur mit Medium (35,78 ± 3,57) (Abb. 3c).Die Zellproliferation wurde auch unter Verwendung einer Wachstumskurve überwacht, indem die Änderung der mittleren Konfluenz (% belegte Fläche) über die Zeit gemessen wurde (Abb. 3d).In Übereinstimmung mit den Ki67-Daten waren sowohl 0,5 als auch 1 Gew.-% Poly(CEP) allein in der Lage, die RPE-Zellproliferation zu unterdrücken.Darüber hinaus wurden Lactatdehydrogenase (LDH)-Assays durchgeführt, um zu bestätigen, dass Poly(CEP) bei allen Konzentrationen (unter und über CMC) für ES-RPE-Zellen nicht zytotoxisch war (Fig. 3e).Zusammengenommen war Poly(CEP) in der Lage, die Proliferation sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von TNT in einer konzentrationsabhängigen Weise (dh oberhalb der CMC, wodurch Mizellen gebildet werden) zu unterdrücken, was darauf hindeutet, dass dies ein Mizellen-spezifisches Phänomen ist.a Die Proliferation in RPE-Zellen, die Poly(CEP)-Micellen bei 0,1, 0,5 und 1 Gew.-% mit TNT ausgesetzt wurden, wurde durch Ki67 IF festgestellt.Nur 1 Gew.-% Poly(CEP) verringerte sichtbar die Anzahl von Ki67-positiven Kernen.Membranen sind durch weiße Pfeile gekennzeichnet.b Proliferation von RPE-Zellen, die fünf Konzentrationen (unter CMC: 0,001 und 0,01 Gew.-%; über CMC: 0,1, 0,5 und 1 Gew.-%) von Poly(CEP) ohne TNT ausgesetzt wurden, wurden mit Ki67 immungefärbt.Kerne wurden mit Hoechst-Färbung blau gefärbt.Maßstabsleiste für a, b, 100 µm.c Alle fünf Konzentrationen in (b) und nur Medienkontrolle aus (a) wurden auf Kolokalisierung von Ki67 mit Zellkernen quantifiziert (unter Verwendung von Hoechst-Färbung).Diese Co-Lokalisierung wurde als Ki67-positive Kerne (%) aufgetragen, was aktiv proliferierende Zellen am Endpunkt von 72 h anzeigt.Nur Poly(CEP) ≥ 0,5 Gew.-% zeigte eine signifikante Hemmung der Proliferation im Vergleich zur Kontrolle nur mit Medium.Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von fünf Wiederholungen dar.d Die Zellproliferation wurde überwacht, indem eine Kurve unter Verwendung der mittleren Konfluenzfläche (%) von Zellen aufgezeichnet wurde, die in regelmäßigen Abständen (10–12 h) abgebildet wurden und fünf Konzentrationen von Poly(CEP) allein ausgesetzt waren.Nur Poly(CEP) bei ≥ 0,5 Gew.-% zeigte eine signifikante Unterdrückung der Proliferation im Vergleich zur Kontrolle (nur Medium).Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von drei Wiederholungen dar.Die Zytokompatibilität von Poly(CEP) bei denselben Konzentrationen wurde unter Verwendung eines Zytotoxizitäts-Lactatdehydrogenase (LDH)-Assays untersucht.Die LDH-Freisetzung (%) war bei allen Konzentrationen von Poly(CEP) und Kontrollmedium nur vernachlässigbar.Als Positivkontrolle wurde Lysepuffer (vom Hersteller bereitgestellt) verwendet.Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von drei Wiederholungen dar.f Es wurde ein Kratzwundenheilungsassay durchgeführt, um die Migration von RPE-Zellen zu untersuchen.Die Zellen wurden zwei Konzentrationen von Poly(CEP) (0,1 und 1 Gew.-%) mit oder ohne TNT ausgesetzt.Phasenkontrastbilder aller Gruppen wurden zu vier Zeitpunkten (0, 12, 24 und 36 h) mit Kratzwundenmaske in Blau aufgenommen.Maßstabsleiste, 300 µm.g Wundheilung (%) wurde zu drei Zeitpunkten (12, 24 und 36 h) nach dem Kratzen quantifiziert.Nur Poly(CEP) bei 1 Gew.-% zeigte am Endpunkt von 36 h eine signifikante Abschwächung der Migration im Vergleich zur Kontrolle nur mit Medium.Diese Abschwächung wurde auch für 1 Gew.-% Poly(CEP) + TNT im Vergleich zu TNT beobachtet.Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von fünf Wiederholungen dar.Statistische Analysen wurden für c–e und g unter Verwendung einer einfachen ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem Post-Hoc-Test mit Tukey's Honour Significant Difference (HSD).ns, nicht signifikant.Die Migration von RPE-Zellen zur epiretinalen Oberfläche ist ein Schlüsselschritt bei der Bildung von ERM und PVR45.Um zu bestimmen, ob Poly(CEP) die ES-RPE-Zellmigration unterdrückt, wurden zwei Konzentrationen von Poly(CEP) (oberhalb seiner CMC; 0,1 und 1 Gew.-%) verwendet, entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von TNT.Phasenkontrastbilder wurden in 12-Stunden-Intervallen bis zu 36 Stunden aufgenommen (Abb. 3f) und der Wundverschluss wurde basierend auf dem verbleibenden zellfreien Bereich zu den verschiedenen Zeitpunkten als Proxy für die Zellmigrationsraten quantifiziert (Abb. 3g).Eine Abschwächung der Zellmigration durch Poly(CEP) wurde nur für die Gruppe mit 1 Gew.-% Poly(CEP) allein nach 36 h beobachtet (55,56 ± 7,86 %, P < 0,0001), nicht jedoch für 0,1 Gew.-% Poly(CEP) (73,72 ± 6,19 %, ns), im Vergleich zur Kontrolle nur mit Medium (75,06 ± 3,21 %).In ähnlicher Weise war die RPE-Zellmigration nur in der Gruppe mit 1 Gew.-% Poly(CEP) + TNT (78,22 ± 5,45 %, P = 0,0001), aber nicht in der Gruppe mit 0,1 Gew.-% Poly(CEP) (92,33 ± 3,30 %, ns) reduziert , verglichen mit TNT-Kontrollen (96,37 ± 1,83 %).Dies weist darauf hin, dass wie erwartet die ES-RPE-Migration nur bei 1 Gew.-% Poly(CEP) unterdrückt wurde.In dem TNT-induzierten RPE-Kontraktionsmodell von PVR schienen 1 Gew.-% Poly(CEP)-exponierte Zellen eine mesenchymähnliche Morphologie anzunehmen (Stadium 1), entwickelten sich jedoch nicht zu den Stadien 2, 3 und 4 (Abb. 2e). , was auf eine unvollständige EMT hindeutet.Daher untersuchten wir, ob die intrazelluläre Aufnahme von Poly(CEP)-Micellen die Genexpression von EMT-vermittelnden Transkriptionsfaktoren unterdrückt.Reverse Transkription-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) und IF-Mikroskopie wurden für die wichtigsten EMT-Transkriptionsfaktoren und ihre nachgeschalteten Ziele durchgeführt.Mit 1 Gew.-% Poly(CEP) + TNT behandelte ES-RPE-Zellen verloren ihre epitheliale Identität, wie durch diskontinuierliche Zellgrenzen, abgegrenzt durch TJP1 (ZO-1)-Färbung, eine Verringerung der CDH1 (E-Cadherin)-Färbung und den Verlust von Kern-OTX2-Markierung (Abb. 4a).In Übereinstimmung damit wurden die mRNA-Expressionsniveaus für wichtige epitheliale Gene wie Rpe65, Otx2, Tjp1 und Cdh1 sowohl durch TNT als auch durch 1 Gew.-% Poly(CEP) + TNT reduziert, was auf einen teilweisen Verlust des epithelialen Phänotyps hinweist (Ergänzende Abb. 6 ).a RPE-Zellen, die 72 h mit TNT mit oder ohne Poly(CEP) behandelt wurden, wurden mit RPE-spezifischem Transkriptionsfaktor: OTX2 und Zellverbindungskomplexproteinen: TJP1 (ZO-1) und CDH1 (E-Cadherin) immungefärbt.Die in Gegenwart von TNT beobachtete Fehllokalisierung von CDH1, TJP1 und Reduktion von OTX2 wurde für TJP1 in Gegenwart von 1 Gew.-% Poly(CEP) teilweise umgekehrt.b Immunfärbung mit EMT-Transkriptionsfaktor (TF): SNAI1 (Schnecke) und ECM-Proteine: COL1A1 und FN1 (Fibronectin) zeigten Hochregulierung mit TNT.1 Gew.-% Poly(CEP) + TNT schützten die Zellen vor dieser Hochregulierung.Kerne wurden mit Hoechst-Färbung blau gefärbt.Maßstabsleiste für a, b, 20 µm.Ein repräsentatives Bild wird für a, b aus drei unabhängigen durchgeführten Experimenten gezeigt.c EMT-TFs (Foxs1, Snai1 und Snai2) und wichtige nachgeschaltete mesenchymale Gene (Col1a1, Fn1 und Cdh2) wurden durch quantitative PCR (qPCR) quantifiziert.Die TNT-induzierte Hochregulierung von EMT TF wurde in Gegenwart von 1 Gew.-% Poly(CEP) gehemmt.Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von drei Wiederholungen für RT-qPCR dar.Die statistische Analyse wurde unter Verwendung einer einfachen ANOVA berechnet, gefolgt von einem Post-Hoc-Test mit ehrlicher Signifikanzdifferenz nach Tukey (HSD).ns, nicht signifikant.ES-RPE-Zellen, die mit 1 Gew.-% Poly(CEP) + TNT behandelt wurden, wiesen im Vergleich zu TNT allein eine verringerte Expression des EMT-Masterregulators SNAI1 (Schnecke) und nachgeschalteter mesenchymaler Proteine ​​wie COL1A1 und FN1 (Fibronectin) durch IF-Mikroskopie auf (Abb. 4b).Dies wurde weiter durch RT-qPCR bestätigt, wobei die Hochregulierung der EMT-Transkriptionsfaktoren Foxs1 (P = 0,0016), Snai1 (P < 0,0001) und Snai2 (P < 0,0001) und nachgeschalteter ECM-Gene wie Col1a1 (P < 0,0001). ) und Fn1 (P = 0,0002), und das Verbindungsgen Cdh2 (P = 0,0002) wurde auf mRNA-Ebene in der TNT-Gruppe beobachtet und durch 1 Gew.-% Poly(CEP) unterdrückt (Abb. 4c).Dies deutet darauf hin, dass die internalisierten Polymermizellen das EMT-Signalnetzwerk beeinträchtigen konnten.Um die vorgeschalteten molekularen Mechanismen, die die durch die intrazelluläre Aufnahme von Poly(CEP)-Micellen ausgelöste Anti-Narbenbildung untermauern, weiter aufzuklären, führten wir eine RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) an ES-RPE-Zellen durch, die 1 Gew.-% Poly(CEP) in Abwesenheit ausgesetzt waren oder Anwesenheit von TNT um 8 und 24 h.Triplikate von jeder Bedingung zeigten eine hohe Übereinstimmung (r ≥ 99 %) in Heatmap-Korrelation und Hauptkomponentenanalyse (PCA)-Plots (ergänzende Abb. 7a, b).PCA zeigte eine unterschiedliche Gruppierung von Proben für jede Bedingung, was darauf hinweist, dass es einzigartige Änderungen des Transkriptomprofils in ES-RPE-Zellen gab, die TNT allein, Poly(CEP) allein oder in Kombination bis 8 h ausgesetzt waren, die sich bis 24 h weiter verstärkten.Wir verwendeten DESeq2, um die differentiell exprimierten Gene (DEGs) zwischen den vier Bedingungen zu beiden Zeitpunkten zu identifizieren.In Übereinstimmung mit den PCA-Ergebnissen zeigten diese Vergleiche signifikante Veränderungen im Expressionsniveau von 3781 und 5162 Genen in Poly(CEP) + TNT im Vergleich zu TNT und 3472 Gene und 6644 Gene in Poly(CEP) allein im Vergleich zur Kontrolle nur mit Medium bei 8 bzw. 24 h (ergänzende Fig. 7c, d und ergänzende Daten 1 für vollständige DE-Gene beider Vergleiche, + Zeitpunkte).62 % der DEGs (dh 1484 von 2380) in der Poly(CEP) + TNT-Gruppe wurden auch in der Poly(CEP)-Gruppe hochreguliert (Abb. 5a und ergänzende Abb. 8a).Dies bestätigt weiter unsere Hypothese, dass das Phänomen der In-vitro-PVR-Prävention hauptsächlich durch Poly(CEP)-induzierte Genexpression vermittelt wird.ein Venn-Diagramm, das die Überlappung von differentiell exprimierten Genen (Wald-Test, Padj < 0,05) zeigt, die durch DESeq2 24 h nach Exposition gegenüber Medien, Poly(CEP), TNT oder Poly(CEP) + TNT identifiziert wurden.1484-Gene sind sowohl in mit Poly(CEP) als auch mit Poly(CEP) + TNT behandelten RPE-Zellen gemeinsam.Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.CAS PubMed-Artikel Google ScholarMed.Klin.Erw.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarWissenschaft.Wissenschaft.Klin.CAS PubMed PubMed Central-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarWissenschaft.Wissenschaft.Nat.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarWissenschaft.Med.Nat.Eng.CAS PubMed-Artikel Google ScholarNat.CAS PubMed-Artikel Google ScholarKlin.CAS PubMed-Artikel Google ScholarMed.CAS PubMed PubMed Central-Artikel Google 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